Pagina principală Pagina principală       Contact Contact       Harta site Harta site
Pagina principală Str. Dr. Aurel Lazăr Nr. 6, Alba Iulia
Contact 0258 811 083

Uleiul de masline ozonizat

Elucidarea structurii uleiului de măsline ozonizat

Rezumat

          Uleiul de măsline ozonizat a fost preparat prin inserarea gazului ozon-oxigen în uleiul de măsline până la solidificarea acestuia. Spectrele 1H și 13C-NMR ale uleiului ozonizat au arătat că toate legăturile duble C-C din triacilglicerol au fost transformate în ozonidă.  Spectrele nu au arătat nicio altă schimbare în structură, indicând de asemenea absența produșilor de degradare ai ozonidei, precum aldehide și acizi carboxilici. Cromatograma HPLC a uleiului a indicat trei vârfuri principale, dintre care două se datorau ozonidelor derivate din trioleină, triacilglicerolul principal (45%) din uleiul de măsline. Aceste rezultate indică triozonidele de trioleină ca fiind compușii principali ai uleiului de măsline ozonizat.

Introducere

      Uleiul de măsline ozonizat este obținut prin inserarea gazului ozon-oxigen în ulei de măsline pur până la solidificarea acestuia. În țările europene uleiul de măsline ozonizat a fost utilizat în tratarea diferitelor afecțiuni cutanate, pentru dezinfectarea leziunilor și susținerea vindecării acestora . Deși în Japonia terapia cu ulei de măsline ozonizat nu a beneficiat de  suficientă atenție, am demonstrat recent că uleiul ozonizat este benefic pacienților suferind de fistule sau răni dificile. Se presupune că uleiul de măsline ozonizat conține ozonide și peroxizi  dar,până în prezent nu au apărut dovezi experimentale definitive privind structura lor în literatura de specialitate. Standardizarea calității este foarte importantă pentru uzul medical al uleiului de măsline ozonat. În această lucrare am analizat datele spectrelor uleiului de măsline ozonizat pentru a elucida structura compusului său principal. S-a analizat de asemenea stabilitatea uleiului ozonizat printr-o cromatografie lichidă de înaltă performanță (HPLC).

Experiment

Materiale

                Uleiul de măsline (medicament din Farmacopeea Japoneză), trioleina și trilinoleina au fost furnizate de Pure Chemicals Industries Ltd. (Osaka, Japonia). Alte standarde autentice de triacilglicerol, precum LLO, LLP, POL, OPO, OOP și OOS (O: acid oleic, L: acid linoleic, P: acid palmitic, S: acid stearic) au fost achiziționate de la Sigma Chemical Co. (St. Louis, Mo, USA). HPLC 2-propanol și acetonitril au fost procurate de la Kanto Chemical (Tokyo, Japonia). Apa Milli-Q (Nihon Millipora Kogyo, Yonezawa, Japonia) a fost utilizată pentru prepararea fazei mobile. Toți ceilalți reactivi utilizați erau cu grad analitic.

Echipament

           Spectrele rezonanței magnetice nucleare 1H și 13C (RMN) au fost înregistrate cu ajutorul unui spectrometru JEOL JNM-EX400 la 400 și 100 MHz, respectiv în CDCl3 utilizând ca standard intern tetrametilsilan. Spectrele infraroșii (IR) au fost înregistrate cu ajutorul unui spectrofotometru JASCO FT-IR-8900. Spectrele de masă și de absorbție au fost măsurate pe spectrofotometrele JEOL JMS-700TZ respectiv Shimadzu UV-260. Sistemul HPLC (Shimadzu, Kyoto, Japonia) a avut în componență o pompă LC-10ADvp, un degazor DGU-12 A, un injector Rheodyne 7725 (Rheodyne, Cotati, CA, USA), un termostat CTO-10A, un detector de absorbție SPD-10AD și un procesor de date C-R5A. Pentru generarea ozonului s-a folosit Nippon Ozone Modelele OT-31ST-M1 și Me-Zone.

Prepararea uleiului de măsline ozonizat

               Uleiul de măsline (190 g) a fost încălzit într-o baie de apă la 30ºC. Amestecul de  oxigen-ozon cu un conținut de 10 ppm ozon a fost apoi inserat in uleiul de măsline la o rată de 1.0 L/min timp de 50 ore pentru a da uleiului ozonizat un aspect de vaselină cu un miros distinct de ozon. Uleiul de măsline ozonizat a fost depozitat într-un frigider.

Analize HPLC ale uleiului de măsline și ale uleiului de măsline ozonizat

Separarea HPLC a fost realizată la 40ºC cu o coloană Develosil ODS UG-3 (100 x 4,6 mm i.d., 3 μm, Nomura Chemicals, Seto, Japonia) ca și coloană analitică care a fost protejată de o coloană guard-pak (Develosil ODS UG-5, 10 x 4,0 mm i.d., 5 μm). În faza mobilă au fost utilizate o mixtură de 1:2 de 2-propanol și acetonitril la 1,2 mL/min pentru uleiul de măsline și 84% acetonitril în soluție apoasă la 1,0 mL/min pentru uleiul de măsline ozonizat. Uleiul de măsline și triacilglicerolii autentici au fost dizolvați în CHCl3 sau CH2Cl2 (0,036% soluție) iar uleiul de măsline ozonizat într-o mixtură de 1:2 CHC l3 și acetonitril (0,63% soluție). Douăzeci de microlitri din fiecare soluție au fost injectați în coloana HPLC, iar eluția a fost monitorizată la 210 nm.

 

 

Rezultate și discuții

      Uleiul de măsline este un amestec de triacilgliceroli (trigliceride), conținând reziduuri de acid gras nesaturat, precum acid oleic și acid linoleic, al căror conținut este considerat a fi 75-85% respectiv 6-10% (2). În experimentele noastre pentru prepararea uleiului de măsline ozonat, aproximativ 160 mg de ozon a fost absorbit per 1,0 g ulei de măsline, ceea ce părea a fi suficient pentru a reacționa cu toate legăturile duble C-C din reziduurile de acid gras nesaturat.

Figura 1 arată spectrul 13C-NMR al uleiului de măsline și al uleiului de măsline ozonizat. Comparativ cu spectrul 13C-NMR al trioleinei și trilinoleinei autentice, semnalele mari la 130 ppm au fost asociate carbonului olefinic din acidul oleic, în vreme ce semnalele mici la 128 ppm erau datorate acidului linoleic. Ozonizarea uleiului de măsline a avut drept consecință dispariția completă a semnalelor carbonului olefinic, odată cu apariția altor semnale la aproximativ 105 ppm. În concordanță cu această modificare, două seturi de semnale triple de protoni au apărut la 5,14, respectiv 5,18 ppm, odată cu dispariția completă a semnalelor protonului olefinic în jur de 5,35 ppm în spectrul 1H-NMR al uleiului de măsline ozonizat. S-a observat că o ozonidă Criegee de oleat de metil arăta semnalele inelului de carbon la aproximativ 104 ppm și două semnale triple la 5,13 și 5,18 ppm pentru inelele de protoni ozonizați ai izomerilor cis și trans (4). În plus,  uleiul de măsline ozonizat nu a prezentat nicio absorbție mai sus de 210 nm în spectrul UV, însă a arătat o absorbție de 1110 cm-1 în spectrul IR, care putea fi asociat unei legături C-O-C a inelului de ozonidă (4). Aceste date spectrale au indicat în mod clar că toate legăturile duble C-C ale reziduurilor de acid gras nesaturat din uleiul de măsline erau transformate în ozonidă Criegee. De vreme ce spectrele 1H- și 13C-NMR ale uleiului de măsline ozonizat nu prezentau nicio altă modificare structurală în triacilglicerol și absența produșilor de descompunere precum aldehide și acizi carboxilici. Astfel, concluzionăm că uleiul de măsline ozonizat este un amestec de ozonide de triacilglicerol.

Figura 1. Spectrele 13C-NMR  ale uleiului de măsline și ale uleiului de măsline ozonizat.

   * Semnale datorate acidului linoleic

Figura 2 arată cromatogramele HPLC ale uleiului de măsline și uleiului de măsline ozonizat. Cu faza mobilă a unei mixturi de 1:2 de 2-propanol și acetonitril, trioleina (OOO) a apărut la 23,2 min (vârf 5) și a cuprins aproximativ 45% din totalul triacilglicerolilor din uleiul de măsline.  

Figura 2. Cromatogramele HPLC ale uleiului de măsline și uleiului de măsline ozonizat. Faza mobilă compusă dintr-un amestec 1:2 de 2-propanol și acetonitril la 1,2 mL/min pentru uleiul de măsline și 84% acetonitril în substanță apoasă la 1,0 mL/min pentru uleiul de măsline ozonizat.

Comparativ cu timpul de retenție al triacilglicerolului autentic, alte vârfuri – 1, 2, 4, 6 și 7 au fost atribuite trilinoleinei (LLL), LLP, POL, OPO (sau OOP) și OOS. Totuși, suma acestor triacilgliceroli a fost sub 20%. Deși vârful 3 nu a fost atribuit, din cauza lipsei de standard autentic, s-a presupus ca fiind determinat de LOO sau OLO, după timpul său de retenție.

Odată cu procesul de ozonizare al uleiului de măsline, toate vârfurile datorate triacilglicerolilor au dispărut, în timp ce cele trei vârfuri principale au fost detectate în cromatograma HPLC cu o fază mobilă mai polară de 84% acetonitril în substanță apoasă. Vârfurile 2 și 3 au fost de asemenea vizibile în cromatograma HPLC a triozonidelor de trioleină preparate prin ozonizarea trioleinei. Astfel, se poate concluziona că principalii compuși (aproximativ 45%) ai uleiului de măsline ozonizat sunt triozonidele de trioleină (Fig. 3). Datorită faptului că izomerii cis și trans ai ozonidei sunt amândoi prezenți în uleiul de măsline ozonizat după cum este descris mai sus, există posibilitatea ca uleiul de măsline ozonizat să conțină șase izomeri de triozonidă de trioleină. Astfel, vârfurile 2 și 3 se datorează probabil amestecului izomeric de triozonidă de trioleină. Același studiu a fost realizat pe ulei de șofrănel ozonizat, aparand rezultate similare.

Figura 3 Structura triozonidei de trioleină

Uleiul de măsline ozonizat se consideră a fi stabil deoarece mici scăderi ale efectului său bactericid au fost înregistrate doar după un timp de păstrare de 8 ani (5). Stabilitatea uleiului de măsline ozonizat a fost de asemenea analizată prin titrare iodometrică (2). Totuși, puțin se știe despre stabilitatea ozonidelor triacilglicerolului. Din acest motiv am examinat stabilitatea acestora prin utilizarea metodei HPLC descrisă mai sus. S-a concluzionat că termostabilitatea triozonidelor de trioleină (vârful 2 și 3 din Fig. 2) din uleiul de măsline ozonizat era relativ înaltă de vreme ce extinderea descompunerii era mai mică de 5% la încălzirea la 50ºC pentru 30 ore în ciclohexan. Cu toate acestea, conținutul triozonidelor a scăzut cu 95-87% după repetarea procedurilor de topire și înghețare a uleiului de măsline ozonizat de 6 ori în tub deschis. Pe de altă parte, în tub închis, triozonidele erau stabile la temperatura camerei timp de 3 luni,iar în frigider timp de cel puțin 2 ani.